產品采集與樣品處理

于同(tong)一批 號的 二個運輸(shu)包裝中至少抽取 12個蕞小銷(xiao)售(shou)包裝樣品(pin)，1/4樣品(pin)用于檢測，1/4樣品(pin)用于留樣，另 1/2樣品(pin)（可就地封存）必要時用于復檢。抽樣的蕞小銷(xiao)售(shou)包裝不(bu)應(ying)有破裂，檢驗前(qian)不(bu)得啟開。

在100級(ji)凈化條件下用無菌方(fang)法打開用于檢(jian)測的(de)至少(shao) 3個包裝(zhuang)，從(cong)每個包裝(zhuang)中(zhong)取樣(yang)，準確稱取10g±1g樣(yang)品。剪碎(sui)后加人到200ml滅菌生(sheng)理鹽水(shui)中(zhong)，充分混勻，得到一個生(sheng)理鹽水(shui)樣(yang)液(ye)。液(ye)體產品用原液(ye)直(zhi)接(jie)做樣(yang)液(ye)。

如被檢樣(yang)(yang)品(pin)含有大(da)量吸(xi)水樹脂材料而導致(zhi)不(bu)能吸(xi)出(chu)足夠(gou)(gou)樣(yang)(yang)液(ye)時，稀釋(shi)液(ye)量可按每次(ci) 50ml遞增，直至能吸(xi)出(chu)足夠(gou)(gou)測試用樣(yang)(yang)液(ye)。在計算細菌(jun)菌(jun)落(luo)總數(shu)(shu)與真菌(jun)菌(jun)落(luo)總數(shu)(shu)時相應調整稀釋(shi)度。

B2  細菌菌落總數與初始污染菌檢測方法

本方(fang)法(fa)適(shi)用于產品初(chu)始污染(ran)菌與細菌菌落(luo)總數（以下(xia)統稱(cheng)為細菌菌落(luo)總數）檢測。

B2.1 操作步(bu)驟

待上述生理鹽水樣(yang)液(ye)自然沉(chen)降(jiang)后(hou)取上清液(ye)作菌落(luo)計數(shu)。共(gong)接種 5個平(ping)(ping)皿，每個平(ping)(ping)皿中加人 1ml樣(yang)液(ye)，然后(hou)用冷卻(que)至45℃左右的(de)熔化的(de)營(ying)養(yang)瓊脂培養(yang)基 15～20ml倒人每個平(ping)(ping)皿內混合均勻 。待瓊脂凝(ning)固后(hou)翻(fan)轉(zhuan)平(ping)(ping)皿置 35℃±2℃培養(yang) 48h后(hou)，計算(suan)平(ping)(ping)板上的(de)菌落(luo)數(shu)。

B2.2 結果報告(gao)

菌(jun)落(luo)呈片(pian)狀(zhuang)生長(chang)的(de)(de)平(ping)板不(bu)宜采用(yong)；計(ji)數符(fu)合要求的(de)(de)平(ping)板上(shang)的(de)(de)菌(jun)落(luo)，按式（B1）計(ji)算結果：

X1=A×（K÷5）

式中(zhong)X1—–細菌菌落總數 cfu/g或cfu/mL；

A——5塊營養(yang)瓊脂(zhi)培養(yang)基平(ping)板上的細菌(jun)菌(jun)落總數；

K——稀釋度。

當菌(jun)落數在(zai) 100以內，按實有(you)數報告，大于 100時采用二位有(you)效(xiao)數字。

如果樣品菌落總數(shu)超過本標(biao)準的規定(ding)，按 B2.3進(jin)行(xing)復檢和結果報(bao)告。

B2.3 復(fu)檢方法

將留(liu)存(cun)的(de)(de)復(fu)(fu)檢(jian)樣(yang)品依(yi)前法復(fu)(fu)測 2次(ci)(ci)(ci)，2次(ci)(ci)(ci)結果(guo)平均值(zhi)都達到本標準(zhun)的(de)(de)規定(ding)，則判定(ding)被檢(jian)樣(yang)品合格；其中有任(ren)何 1次(ci)(ci)(ci)結果(guo)平均值(zhi)超(chao)過本標準(zhun)規定(ding)，則判定(ding)被檢(jian)樣(yang)品不合格。

B3  大腸菌群檢測方法

B3.1 操作步驟

取樣液(ye) 5ml接種 50ml，乳(ru)糖膽鹽發(fa)酵(jiao)管(guan)，置 35℃±2℃培養(yang) 24h，如不產(chan)酸也(ye)不產(chan)氣，則報告為大腸菌(jun)群(qun)陰性。

如產(chan)酸(suan)產(chan)氣，則劃線接種伊紅美藍瓊脂平板，置35℃±2℃培(pei)養(yang) 18～24h，觀(guan)察平板上菌(jun)落(luo)形態。典(dian)型的大腸(chang)菌(jun)落(luo)為黑紫(zi)色(se)或(huo)(huo)紅紫(zi)色(se)，圓形，邊(bian)緣整齊，表面光滑濕潤(run)，常具有金屬(shu)光澤(ze)(ze)，也有的呈紫(zi)黑色(se)，不帶或(huo)(huo)略帶金屬(shu)光澤(ze)(ze)，或(huo)(huo)粉紅色(se)，中心較(jiao)深的菌(jun)落(luo)。

取(qu)疑似菌落 1-2個作(zuo)革蘭(lan)氏染色鏡檢(jian)，同時接種(zhong)乳糖發醉管，置 35℃±2℃培養 24h，觀察(cha)產(chan)氣(qi)情況。

B3.2 結果報(bao)告

凡乳糖(tang)膽鹽發(fa)酵骨產(chan)(chan)(chan)酸產(chan)(chan)(chan)氣，乳糖(tang)發(fa)酵管產(chan)(chan)(chan)酸產(chan)(chan)(chan)氣，在伊紅美(mei)藍平板上有典型大腸菌落，革蘭氏染色為陰性無芽胞桿菌，可報告(gao)被(bei)檢樣品檢出大腸桿菌。

B4  綠膿桿菌檢測方法

B4.1 操作步驟

取樣液(ye) 5ml，加人(ren)到(dao)50ml SCDLP培(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)液(ye)中，充(chong)分混勻，置 35℃±2℃培(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang) 18～24h。如有(you)綠(lv)膿桿菌(jun)生(sheng)長(chang)，培(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)液(ye)農(nong)面呈現一層薄(bo)菌(jun)膜(mo)，培(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)液(ye)常呈黃綠(lv)色或藍(lan)綠(lv)色。從培(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)液(ye)的薄(bo)菌(jun)膜(mo)處挑取培(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)物，劃(hua)線接種十六烷三甲基溴化胺(an)瓊脂平板，置 35℃±2℃ 培(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang) 18～24h，觀察菌(jun)落特征。綠(lv)膿桿菌(jun)在此培(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)基上生(sheng)長(chang)良好，菌(jun)落扁平，邊緣(yuan)不整，菌(jun)落周圍培(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)基略帶粉紅色，其他菌(jun)不長(chang)。

取(qu)可疑(yi)菌(jun)落(luo)涂片作(zuo)革(ge)(ge)蘭氏染色(se)，鏡檢(jian)為革(ge)(ge)蘭氏陰性(xing)菌(jun)者應進行下列試驗：

氧化(hua)酶(mei)試驗：取(qu)一小塊潔凈的白色濾紙片(pian)放在(zai)(zai)滅(mie)菌平皿內(nei)(nei)，用無菌玻棒挑取(qu)可疑菌落涂(tu)在(zai)(zai)濾紙片(pian)上，然后在(zai)(zai)其上滴加一滴新配制(zhi)的 1%二甲基(ji)對苯二胺試液，30s內(nei)(nei)出現(xian)粉紅色或(huo)紫紅色，為氧化(hua)酶(mei)試驗陽性，不變(bian)色者為陰性。

綠(lv)膿(nong)菌(jun)素(su)試驗(yan)：取(qu)2-3個可(ke)疑菌(jun)落，分(fen)別接種(zhong)在綠(lv)膿(nong)菌(jun)素(su)測定用培(pei)養(yang)基斜面，35℃±2℃培(pei)養(yang)24h，加(jia)入 3～5ml，充分(fen)振蕩使培(pei)養(yang)物中可(ke)能存(cun)在的綠(lv)膿(nong)菌(jun)素(su)溶解，待(dai)三-氯-甲(jia)-烷呈(cheng)藍色時，用吸管移(yi)到另一試管中并加(jia)人 1mol/L的鹽酸1mL，振蕩后(hou)靜置片刻。如上層(ceng)出現粉紅色或紫紅色即為(wei)陽性，表示有綠(lv)膿(nong)菌(jun)素(su)存(cun)在。

硝酸(suan)鹽還原產氣試驗：挑取被檢菌落(luo)純培養物(wu)接種(zhong)在硝酸(suan)鹽脈水培養基中，置 35C12C培養24h培養基小(xiao)倒管中有氣者即為(wei)陽性

明膠液化試(shi)驗:取可疑菌(jun)落純培(pei)(pei)養物(wu)，穿刺接種在明膠培(pei)(pei)養基內，置 35℃±2℃培(pei)(pei)養 24h，取出放于(yu)4～10C，如仍呈液態為陽性(xing)，凝固(gu)者為陰性(xing)。

42℃生長試(shi)驗(yan)：取(qu)可疑培養物，接(jie)種在普通瓊脂(zhi)斜面培養基上，置 42℃培養 24～48h，有綠膿桿(gan)菌生長為陽性。

B4.2 結(jie)果報告

被(bei)(bei)檢(jian)(jian)(jian)樣品經增(zeng)菌(jun)(jun)(jun)分離培養(yang)后，證實為革蘭氏陰性(xing)桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)(jun)，氧化酶及綠(lv)膿桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)(jun)試驗均(jun)為陽(yang)性(xing)者，即可(ke)報告被(bei)(bei)檢(jian)(jian)(jian)樣品中(zhong)(zhong)檢(jian)(jian)(jian)出(chu)(chu)綠(lv)膿桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)(jun) 如綠(lv)膿菌(jun)(jun)(jun)素試驗陰性(xing)而液化明膠、硝酸鹽還原產氣和42℃生長試驗三(san)者皆為陽(yang)性(xing)時，仍可(ke)報告被(bei)(bei)檢(jian)(jian)(jian)樣品中(zhong)(zhong)檢(jian)(jian)(jian)出(chu)(chu)綠(lv)膿桿(gan)(gan)菌(jun)(jun)(jun)。

B5 金黃色葡萄球菌檢測方法

B5.1 操作(zuo)步(bu)驟

取(qu)樣液(ye)(ye) 5ml，加入到 50mL SCDLP培(pei)(pei)養(yang)液(ye)(ye)中(zhong)，充分混勻，置 35℃±2℃培(pei)(pei)養(yang) 24h，自(zi)上(shang)述增菌(jun)(jun)液(ye)(ye)中(zhong)取(qu)1～2接種(zhong)環，劃線接種(zhong)在血瓊(qiong)脂培(pei)(pei)養(yang)基上(shang)，置 35℃±2℃培(pei)(pei)養(yang)24～48h。在血瓊(qiong)脂平板上(shang)該菌(jun)(jun)菌(jun)(jun)落呈(cheng)金黃(huang)色，大而(er)突起，圓形，不(bu)透明，表面光滑，周圍(wei)有溶(rong)血圈。

挑取典型菌落(luo)，涂(tu)片作革蘭(lan)(lan)氏染色(se)鏡檢，金黃色(se)葡(pu)萄球(qiu)菌為(wei)革蘭(lan)(lan)氏陽性球(qiu)菌，排列成葡(pu)萄狀，無芽胞與莢膜。鏡檢符合 上述(shu)情況，應(ying)進行下列試驗：

甘露(lu)醇(chun)發酵試驗：取上述菌(jun)落接(jie)種甘露(lu)醇(chun)培養液(ye)，置 35℃±2℃培養 24h，發酵甘露(lu)醇(chun)產酸者為陽性。

血(xue)漿(jiang)(jiang)凝固(gu)酶(mei)試驗：（1）玻(bo)片法(fa)：取(qu)清潔干燥載玻(bo)片，一端滴(di)(di)(di)加一滴(di)(di)(di)生理(li)鹽(yan)(yan)(yan)水，另一端滴(di)(di)(di)加一滴(di)(di)(di)兔(tu)血(xue)漿(jiang)(jiang)，挑:取(qu)菌(jun)落分(fen)別(bie)與生理(li)鹽(yan)(yan)(yan)水和血(xue)漿(jiang)(jiang)混(hun)合，5min如血(xue)漿(jiang)(jiang)內出現團塊(kuai)(kuai)或顆粒狀凝塊(kuai)(kuai)，而鹽(yan)(yan)(yan)水滴(di)(di)(di)仍呈均(jun)勻混(hun)濁無(wu)凝固(gu)則為(wei)(wei)陽性(xing)，如兩者均(jun)無(wu)凝固(gu)則為(wei)(wei)陰(yin)(yin)性(xing)。凡(fan)鹽(yan)(yan)(yan)水滴(di)(di)(di)與血(xue)漿(jiang)(jiang)滴(di)(di)(di)均(jun)有凝固(gu)現象(xiang)，再(zai)進(jin)行試管(guan)凝固(gu)酶(mei)試驗；（2）試管(guan)法(fa)：吸取(qu) 1：4新鮮血(xue)漿(jiang)(jiang) 0.5ml，放滅(mie)菌(jun)小(xiao)(xiao)試管(guan)中，加入等量待檢菌(jun) 24h肉湯(tang)(tang)培養(yang)物(wu) 0.55mL，混(hun)勻，放 35℃±2℃溫箱或水浴中，每半(ban)小(xiao)(xiao)時(shi)觀(guan)察一次，24h之(zhi)內呈現凝塊(kuai)(kuai)即為(wei)(wei)陽性(xing)。同時(shi)以(yi)已知血(xue)漿(jiang)(jiang)凝固(gu)酶(mei)陽性(xing)和陰(yin)(yin)性(xing)菌(jun)株肉湯(tang)(tang)培養(yang)物(wu)各0.5ml，作為(wei)(wei)陽性(xing)與陰(yin)(yin)性(xing)對照。

B5.2 結(jie)果報(bao)告

凡在(zai)瓊脂平(ping)板(ban)上(shang)有可疑菌(jun)落生長，鏡檢為革(ge)蘭氏陽性葡(pu)萄球菌(jun)，并能發(fa)酵甘露醇(chun)產酸，血(xue)漿凝固酶試(shi)驗陽性者，可報(bao)告被檢樣品檢出金(jin)黃色葡(pu)萄球菌(jun)。

B6 溶血性鏈球菌檢測方法

B6.1 操(cao)作步驟

取樣液 5ml加(jia)人(ren)到(dao) 50ml葡萄糖肉湯， 35℃±2℃培(pei)養(yang)(yang) 24h，將(jiang)培(pei)養(yang)(yang)物劃線接(jie)種血(xue)(xue)瓊脂平(ping)(ping)板(ban)(ban)， 35℃±2℃培(pei)養(yang)(yang)24h觀察(cha)菌落特征(zheng)。溶血(xue)(xue)性(xing)鏈(lian)球菌在血(xue)(xue)平(ping)(ping)板(ban)(ban)上為(wei)灰自色(se)，半透明(ming)(ming)或不透明(ming)(ming)，針尖狀(zhuang)突起，表面(mian)光滑(hua)，邊緣整齊(qi)，周圍(wei)有無色(se)透明(ming)(ming)溶血(xue)(xue)圈。

挑(tiao)取典型(xing)菌落作涂片(pian)革蘭氏染色(se)鏡(jing)檢(jian)，應為(wei)革蘭氏陽(yang)性，呈鏈(lian)狀排列(lie)的球菌。鏡(jing)檢(jian)符合上述情況(kuang)，應進行下列(lie)試驗：

鏈激酶試驗：吸取(qu)(qu)草酸(suan)鉀(jia)血(xue)漿 0.2ml（0.01g草酸(suan)鉀(jia)加5mL兔血(xue)漿混(hun)勻，經離(li)心沉淀，吸取(qu)(qu)上清液），加人(ren) 0.8ml滅菌生理鹽水(shui)，混(hun)勻后再加人(ren)待檢菌 24h肉(rou)湯(tang)培(pei)養物0.5ml和0.25%氯化(hua)鈣0.25ml，混(hun)勻，放 35℃±2℃水(shui)浴中，2min觀察(cha)一次（一般10min內可凝固），待血(xue)漿凝固后繼(ji)續觀察(cha)并記錄溶化(hua)時間。如 2h內不溶化(hua)，繼(ji)續放置 24h觀察(cha)，如凝塊全部(bu)溶化(hua)為陽性(xing)，24h仍不溶化(hua)為陰性(xing)。

桿菌(jun)膚敏感試驗：將被檢(jian)菌(jun)菌(jun)液(ye)涂于血平板上，用滅(mie)菌(jun)鑷子取每片含 0.04單位桿菌(jun)膚的紙片放在平板表面仁，同時以已知陽(yang)性菌(jun)株作對照(zhao)，在 35℃±2℃下放置 18～24h，有抑菌(jun)帶(dai)者為陽(yang)性。

B6.2 結果報告

鏡檢(jian)革(ge)蘭氏陽性(xing)鏈狀排列球菌(jun)，血(xue)平板上呈現溶(rong)血(xue)圈(quan)，鏈激酶和桿(gan)菌(jun)膚(fu)試驗陽性(xing)，可報告被檢(jian)樣(yang)品檢(jian)出溶(rong)血(xue)性(xing)鏈球菌(jun)。

B7 真菌菌落總數檢測方法

B7.1 操作步驟

待上述生理鹽(yan)水樣(yang)液(ye)自然(ran)沉降后(hou)(hou)(hou)取上清液(ye)作真菌計(ji)(ji)數(shu)。共接(jie)種5個(ge)平(ping)(ping)皿，每(mei)個(ge)平(ping)(ping)皿中加(jia)人 1ml樣(yang)液(ye)，然(ran)后(hou)(hou)(hou)用冷卻至(zhi) 45℃左右的(de)熔(rong)化(hua)的(de)沙氏瓊(qiong)(qiong)脂(zhi)培養基 15 ～25mL倒人每(mei)個(ge)平(ping)(ping)皿內混合均勻，瓊(qiong)(qiong)脂(zhi)凝固后(hou)(hou)(hou)翻轉平(ping)(ping)皿置 25℃±2℃培養 7天(tian)，分別于 3，5，7天(tian)觀察，計(ji)(ji)算(suan)平(ping)(ping)板(ban)上的(de)菌落數(shu)，如(ru)果發(fa)現菌落蔓延，以前 一次的(de)菌落計(ji)(ji)數(shu)為準。

B7.2 結果報(bao)告

菌(jun)落呈(cheng)片(pian)狀(zhuang)生長的(de)平板不(bu)宜(yi)采用；計數符合要求(qiu)的(de)平板上(shang)的(de)菌(jun)落，按式（B2）計算結果(guo)：

X2=B×（K÷5）

式中X2—–真菌菌落總數，cfu/g或cfu/mL；

B—–5塊(kuai)沙氏瓊(qiong)脂培養基平板(ban)上(shang)的(de)真菌菌落總數;

K—–稀(xi)釋度(du)。

當菌落數(shu)在 100以(yi)內(nei)，按實(shi)有數(shu)報(bao)告，大于 100時采用(yong)二位有效數(shu)字。

如(ru)果樣(yang)品菌落總數超過本標準(zhun)的規定，按 B7.3進行復(fu)檢和結果報告。

B7.3 復檢方法

將留存(cun)的復檢(jian)樣品依前(qian)法復測(ce) 2次，2次結果都達到(dao)本標準的規定，則判定被檢(jian)樣品合格；其中有任何 1次結果超(chao)過本標準規定，則判定被檢(jian)樣品不合格。

B8 真菌定性檢測方法

B8.1 操作步驟

取樣液 5mL加入到50mL沙氏培養基中， 25℃±2℃培養 7天，逐日觀察有無真菌生長。 

B8.2 結(jie)果報告

培養(yang)管混(hun)濁應轉(zhuan)種沙氏瓊脂培養(yang)基(ji)，證實有(you)真菌(jun)生長，可(ke)報告(gao)被(bei)檢樣品檢出真菌(jun)。