1.有機物中的胺(an)根(gen)在強熱和CuSO4，濃H2SO4作(zuo)用下，硝化生(sheng)成（NH4）2SO4
反(fan)應(ying)式(shi)為
2NH2 H2S04 2H＝（NH4）2S04（其中CuSO4做催化劑(ji)）
2.在凱(kai)氏定氮器中(zhong)與堿(jian)作用，通過蒸(zheng)餾釋放(fang)出NH3，收集于H3BO3溶(rong)液中
反應式(shi)為:
（NH4）2SO4 2NaOH＝2NH3 2H2O Na2SO4
2NH3 4H3BO3＝（NH4）2B4O7 5H2O
3.用已知濃度的H2SO4（或HCI）標準溶液滴定，根(gen)據HCI消耗的量計算出氮(dan)的含量，然(ran)后乘以相(xiang)應的換算因子，既得蛋白質(zhi)的含量點焊機
反(fan)應式為：
（NH4）2B4O7 H2SO4 5H2O＝（NH4）2SO4 4H3BO3（NH4）2B4O7 2HCl 5H2O＝2NH4Cl 4H3BO3

凱(kai)氏定(ding)氮儀(yi)操作步驟：（一）消(xiao)化1、準(zhun)備6個凱氏燒瓶，標(biao)號。1、2、3號(hao)燒瓶中(zhong)分別加入適當濃(nong)度的蛋白溶液1.0mL，樣品(pin)要加到燒瓶(ping)(ping)底部，切勿(wu)沾在瓶(ping)(ping)口及瓶(ping)(ping)頸上。再依(yi)次加入硫(liu)酸(suan)鉀-硫(liu)酸(suan)銅(tong)接觸劑0.3g，濃硫(liu)酸2.0mL，30%過氧化氫1.0mL。4、5、6號燒瓶作為空白(bai)對照，用以(yi)測定試劑中可能含有的微(wei)量含氮物質，對樣品測定進(jin)行校(xiao)正。4、5、6號燒瓶中加入蒸餾水1.0mL代替(ti)樣液，其余所加試劑與1、2、3號燒瓶相同。2、將加(jia)好(hao)試(shi)劑的各燒瓶放置消(xiao)(xiao)化(hua)(hua)架上，接(jie)好(hao)抽氣裝置。先用微火加(jia)熱(re)煮沸，此時燒瓶內物質炭化(hua)(hua)變(bian)黑(hei)，并產(chan)生大量(liang)泡(pao)(pao)沫，務必注意防止氣泡(pao)(pao)沖出管口。待泡(pao)(pao)沫消(xiao)(xiao)失停止產(chan)生后，加(jia)大火力(li)，保(bao)持瓶內液體微沸，至溶液澄(cheng)清后，再(zai)繼續(xu)加(jia)熱(re)使消(xiao)(xiao)化(hua)(hua)液微沸15min。在消化(hua)過程中要隨時轉動燒(shao)瓶，以使內壁粘著物質均能流入底部，以保證(zheng)樣(yang)品完全消化(hua)。消化(hua)時放(fang)出的氣體內含SO2，具有(you)強烈刺(ci)激性，因此自始自終應打開(kai)抽(chou)水(shui)泵(beng)將氣(qi)體(ti)抽(chou)入(ru)自來水(shui)排出。整個消化過程均應在(zai)通風櫥中進(jin)行。消化完全后(hou)，關閉火焰(yan)，使燒瓶冷卻至室溫。（二）蒸餾(liu)和吸收蒸餾(liu)和吸收是在(zai)微(wei)量凱氏定(ding)氮儀內進(jin)行的。

凱氏(shi)定氮蒸(zheng)餾裝置種(zhong)類甚多，大體(ti)上(shang)都由蒸(zheng)氣發生、氨的蒸(zheng)餾和(he)氨的吸收三部分組成。

1、儀(yi)器的洗滌儀(yi)器安裝前，各部件需經一般方法洗滌干凈，所用橡皮管、塞須(xu)浸在10%NaOH溶液中，煮約10min，水洗、水煮10min，再水洗數次(ci)，然后安裝并固定在一只鐵(tie)架臺上。儀器使用(yong)前(qian)，微量(liang)全(quan)部管道(dao)都須經(jing)水蒸(zheng)氣洗滌，以除(chu)去(qu)管道(dao)內(nei)可能殘(can)留(liu)的氨，正在使用(yong)的儀器，每(mei)次(ci)測樣前(qian)，蒸(zheng)氣洗滌5min即可。較長(chang)時間未使用的儀(yi)器(qi)(qi)，重復蒸(zheng)氣(qi)(qi)洗滌，不(bu)得少于三次，并檢查儀(yi)器(qi)(qi)是否(fou)正常。仔細檢查各個連接處(chu)，保證不(bu)漏氣(qi)(qi)。首(shou)先(xian)在蒸(zheng)氣(qi)(qi)發(fa)生器(qi)(qi)中加約2/3體積蒸餾水，加入數滴硫酸(suan)使其保持酸(suan)性，以避免水中(zhong)的(de)氨被(bei)蒸出(chu)而(er)影響結果，并放入少許沸石(shi)（或毛細管等），以防爆沸。沿(yan)小(xiao)玻杯壁加入蒸餾水約20mL讓水(shui)經插管流入反(fan)應室，但玻(bo)杯內(nei)的水(shui)不要放光，塞上棒狀(zhuang)玻(bo)塞，保持水(shui)封，防(fang)止(zhi)漏氣(qi)(qi)。蒸氣(qi)(qi)發生后，立即關閉廢(fei)液排放管上的開(kai)關，使蒸氣(qi)(qi)只能(neng)進(jin)入反(fan)應室，導(dao)致(zhi)反(fan)應室內(nei)的水(shui)迅速沸騰，蒸出(chu)蒸氣(qi)(qi)由反(fan)應室上端口通過定(ding)氮球進(jin)入冷(leng)凝管冷(leng)卻，在冷(leng)凝管下端放置一個錐(zhui)形瓶接收(shou)冷(leng)凝水(shui)。從定(ding)氮球發燙開(kai)始計時，連續蒸煮5min，然(ran)后(hou)移(yi)開煤氣(qi)燈。沖洗完畢(bi)，夾緊蒸氣(qi)發生器(qi)與收集器(qi)之(zhi)間的連(lian)接橡膠(jiao)管(guan)，由于氣(qi)體冷卻壓力降(jiang)低，反應室內(nei)廢液(ye)自(zi)動抽(chou)到反應室外殼中，打開廢液(ye)排出口(kou)夾子(zi)放(fang)出廢液(ye)。如此清洗2～3次，再在冷(leng)凝管下換(huan)放一個盛有硼酸-指示(shi)劑混(hun)合液(ye)的錐(zhui)形瓶使(shi)冷凝管下口完全(quan)浸(jin)沒在溶液(ye)中(zhong)，蒸餾1～2min，觀察(cha)錐(zhui)形(xing)瓶內的溶(rong)液是否變(bian)色(se)。如不(bu)變(bian)色(se)，表示蒸(zheng)餾裝置(zhi)內部已洗干凈。移去錐(zhui)形(xing)瓶，再(zai)蒸(zheng)餾1～2min，用蒸餾(liu)水沖洗冷(leng)凝器(qi)下口，關閉煤氣燈，儀器(qi)即可供測(ce)樣品(pin)使用。

2、無(wu)機氮標(biao)準樣(yang)品的(de)(de)(de)蒸餾(liu)(liu)吸收(shou)由于定(ding)氮操作繁瑣，為(wei)了(le)熟(shu)悉蒸餾(liu)(liu)和滴(di)定(ding)的(de)(de)(de)操作技術，初學者宜先用(yong)無(wu)機氮標(biao)準樣(yang)品進行反復練習，再進行有機氮未知樣(yang)品的(de)(de)(de)測定(ding)。常(chang)用(yong)巳(si)知濃(nong)度的(de)(de)(de)標(biao)準硫酸銨測試(shi)三次。取(qu)潔凈的(de)(de)(de)100mL錐形瓶五只，依(yi)次加(jia)入2%硼酸溶液20mL，次甲基(ji)藍-甲基紅混(hun)合指示(shi)劑(ji)（呈紫(zi)紅色）3～4滴，蓋好(hao)瓶(ping)(ping)口待用。取(qu)其中(zhong)一(yi)只錐形(xing)瓶(ping)(ping)承接在冷凝(ning)管下端，并使(shi)冷凝(ning)管的出口浸(jin)沒(mei)在溶液中(zhong)。注意：在此操作之前(qian)必(bi)須先打開收集器活塞，以免錐形(xing)瓶(ping)(ping)內液體倒吸(xi)。準確吸(xi)取(qu)2mL硫酸銨標準液(ye)加到玻(bo)杯中，小心提起棒狀(zhuang)玻(bo)塞使硫酸銨溶(rong)液(ye)慢慢流入(ru)蒸餾瓶中，用少量蒸餾水沖洗小玻(bo)杯3次(ci)，一并放人蒸餾瓶中。然后用量筒向小玻杯(bei)中加入(ru)10 mL 30%NaOH溶(rong)液，使堿(jian)液慢(man)慢(man)流入(ru)蒸餾(liu)瓶中，在(zai)堿(jian)液尚未(wei)完全流入(ru)時，將棒狀玻(bo)塞蓋緊。向小玻(bo)杯中加約5mL蒸(zheng)餾(liu)水(shui)，再慢慢打開玻塞，使一(yi)半(ban)水(shui)流入蒸(zheng)餾(liu)瓶(ping)，一(yi)半(ban)留在小(xiao)玻杯中(zhong)作水(shui)封。關閉收集(ji)器活塞，加(jia)熱蒸(zheng)氣發生(sheng)器，進行蒸(zheng)餾(liu)。錐(zhui)形瓶(ping)中(zhong)的硼酸-指示劑(ji)混(hun)合液由于吸收了氨，由紫紅色(se)變(bian)成(cheng)綠色(se)。自(zi)變(bian)色(se)時起，再蒸餾3～5min，移動錐形瓶使瓶內(nei)液(ye)面(mian)離開(kai)冷凝管下口約lcm，并用少量蒸(zheng)餾(liu)水沖洗冷凝管下口，再繼續蒸(zheng)餾(liu)1min，移開錐形瓶，蓋(gai)好，準(zhun)備滴(di)定。在一次蒸餾完畢(bi)后(hou)，移去(qu)煤氣(qi)燈，夾緊蒸氣(qi)發(fa)生器與收集器間的橡膠管，排除反應完畢(bi)的廢液(ye)，用水沖洗小玻杯幾次，并將廢液(ye)排除。如此反復沖洗干(gan)凈(jing)后(hou)，即(ji)可進行(xing)下(xia)一個(ge)樣品的蒸餾。按以上方(fang)法用標準(zhun)硫酸銨再做兩次。另取2mL蒸(zheng)(zheng)餾(liu)水代替標準硫酸銨進行空(kong)白測定二(er)次(ci)。將各次(ci)蒸(zheng)(zheng)餾(liu)的錐形瓶一(yi)起滴(di)定。

3、未知樣(yang)品(pin)及空白(bai)的蒸餾(liu)吸(xi)收將消化(hua)好的蛋白(bai)樣(yang)品(pin)三(san)支，空白(bai)對照液三(san)支，依(yi)次(ci)作蒸餾(liu)吸(xi)收。加5mL熱的(de)蒸餾水(shui)至消化(hua)好的(de)樣品或空白對照液中(zhong)，通過小(xiao)玻杯(bei)加到反(fan)應室中(zhong)，再(zai)用熱蒸餾水(shui)洗滌小(xiao)玻杯(bei)3次，每次用(yong)水量約3mL，洗滌液一(yi)并倒入反應室內。其(qi)余操作按標準硫酸銨(an)的蒸(zheng)餾進行。由(you)于(yu)消化液內硫酸鉀濃度(du)高而呈粘稠(chou)狀，不易從凱氏燒瓶內倒出，必須加入熱蒸(zheng)餾水5 mL稀釋之，如果(guo)有(you)結(jie)晶(jing)析出，必須微熱(re)(re)溶解，趁熱(re)(re)加(jia)入(ru)(ru)玻(bo)杯，使其流(liu)入(ru)(ru)反應(ying)室。此外(wai)，還應(ying)當注意趁儀(yi)器洗滌尚未完全冷卻時立即加(jia)入(ru)(ru)樣品或(huo)空白(bai)對照液(ye)，否則消(xiao)化液(ye)通過冷卻的管(guan)道容(rong)易析出結(jie)晶(jing)，造成堵塞。（三）凱氏定(ding)氮(dan)儀(yi)滴(di)定(ding)樣品和空白(bai)蒸餾完畢后(hou)，一(yi)起進(jin)行滴(di)定(ding)。打開接受瓶(ping)蓋(gai)，用酸式微量滴(di)定(ding)管(guan)以0.0100mol/L的標準鹽酸(suan)溶液進行滴(di)定。待滴(di)至(zhi)瓶(ping)內(nei)溶液呈(cheng)暗灰色時，用(yong)蒸餾水將(jiang)錐形瓶(ping)內(nei)壁四周淋洗一(yi)次。若振(zhen)搖(yao)后復現綠色，應再小心(xin)滴(di)入標準鹽酸(suan)溶液半滴(di)，振(zhen)搖(yao)觀察(cha)瓶(ping)內(nei)溶液顏色變(bian)化，暗灰色在(zai)(zai)一(yi)二分鐘內(nei)不(bu)變(bian)，當視(shi)為到(dao)達滴(di)定終點(dian)。若呈(cheng)粉紅色，表明已超越滴(di)定終點(dian)，可在(zai)(zai)已滴(di)定耗用(yong)的標準鹽酸(suan)溶液用(yong)量中減去0.02mL，每(mei)組樣品的定氮(dan)終點顏色必須(xu)完(wan)全(quan)一致。空(kong)白對照液(ye)接受瓶(ping)內的溶液(ye)顏色不變或略有變化尚未出現綠(lv)色，可以不滴定。記錄每(mei)次滴定耗用標準鹽(yan)酸溶液(ye)毫升數，供計算用。