OOS(outofspecification,超限度(du)、超規格(ge))結(jie)果(guo)(guo)(guo)(guo)(guo)，是(shi)指(zhi)產(chan)(chan)品(pin)(pin)質量(liang)指(zhi)標(biao)(biao)測試中超出(chu)(chu)(chu)(chu)已經建立的(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)接受標(biao)(biao)準的(de)(de)(de)(de)(de)單個(ge)或一系列結(jie)果(guo)(guo)(guo)(guo)(guo)。無(wu)菌(jun)產(chan)(chan)品(pin)(pin)的(de)(de)(de)(de)(de)陽(yang)性(xing)(xing)結(jie)果(guo)(guo)(guo)(guo)(guo)、微(wei)(wei)(wei)生(sheng)物(wu)限度(du)試驗(yan)(yan)(yan)(yan)超出(chu)(chu)(chu)(chu)行(xing)(xing)動值或超過(guo)規格(ge)、內毒素試驗(yan)(yan)(yan)(yan)結(jie)果(guo)(guo)(guo)(guo)(guo)超標(biao)(biao)準等均為OOS結(jie)果(guo)(guo)(guo)(guo)(guo)《中國藥(yao)典(dian)》2015年版(ban)m和(he)(he)(he)新版(ban)《藥(yao)品(pin)(pin)生(sheng)產(chan)(chan)質量(liang)管(guan)理規范》（GMP)增加了(le)OOS調(diao)(diao)查(cha)章節，對(dui)(dui)微(wei)(wei)(wei)生(sheng)物(wu)實驗(yan)(yan)(yan)(yan)室00S結(jie)果(guo)(guo)(guo)(guo)(guo)的(de)(de)(de)(de)(de)調(diao)(diao)查(cha)做出(chu)(chu)(chu)(chu)了(le)較為詳細(xi)的(de)(de)(de)(de)(de)闡(chan)述和(he)(he)(he)實例分析(xi)，要(yao)(yao)求任何OOS結(jie)果(guo)(guo)(guo)(guo)(guo)必須按照(zhao)書面規程進(jin)(jin)行(xing)(xing)完整(zheng)的(de)(de)(de)(de)(de)調(diao)(diao)查(cha)。因(yin)為只有確定了(le)OOS結(jie)果(guo)(guo)(guo)(guo)(guo)產(chan)(chan)生(sheng)的(de)(de)(de)(de)(de)原因(yin)并(bing)判定其(qi)是(shi)否有效(xiao)，進(jin)(jin)而(er)(er)才能(neng)制(zhi)訂(ding)完善的(de)(de)(de)(de)(de)預(yu)防和(he)(he)(he)整(zheng)改措施，以(yi)保證檢(jian)(jian)(jian)驗(yan)(yan)(yan)(yan)結(jie)果(guo)(guo)(guo)(guo)(guo)的(de)(de)(de)(de)(de)準確性(xing)(xing)。因(yin)此，實驗(yan)(yan)(yan)(yan)室建立OOS調(diao)(diao)查(cha)處(chu)(chu)理程序，對(dui)(dui)OOS結(jie)果(guo)(guo)(guo)(guo)(guo)進(jin)(jin)行(xing)(xing)科學、及時、有效(xiao)的(de)(de)(de)(de)(de)調(diao)(diao)查(cha)分析(xi)處(chu)(chu)理是(shi)十(shi)分必要(yao)(yao)的(de)(de)(de)(de)(de)微(wei)(wei)(wei)生(sheng)物(wu)在自然環境中無(wu)處(chu)(chu)不(bu)在，并(bing)可(ke)能(neng)會(hui)隨檢(jian)(jian)(jian)驗(yan)(yan)(yan)(yan)人(ren)員、檢(jian)(jian)(jian)驗(yan)(yan)(yan)(yan)用器材以(yi)及檢(jian)(jian)(jian)品(pin)(pin)的(de)(de)(de)(de)(de)包(bao)裝容器進(jin)(jin)入檢(jian)(jian)(jian)驗(yan)(yan)(yan)(yan)環境。因(yin)此，關于(yu)微(wei)(wei)(wei)生(sheng)物(wu)檢(jian)(jian)(jian)驗(yan)(yan)(yan)(yan)中藥(yao)品(pin)(pin)的(de)(de)(de)(de)(de)無(wu)菌(jun)檢(jian)(jian)(jian)査(cha)項(xiang)目，新版(ban)藥(yao)典(dian)對(dui)(dui)其(qi)操作環境提出(chu)(chu)(chu)(chu)了(le)更高要(yao)(yao)求，新版(ban)GMP也加強(qiang)了(le)對(dui)(dui)無(wu)菌(jun)操作環境空氣微(wei)(wei)(wei)生(sheng)物(wu)、表(biao)面微(wei)(wei)(wei)生(sheng)物(wu)以(yi)及人(ren)員手套和(he)(he)(he)操作服表(biao)面微(wei)(wei)(wei)生(sheng)物(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)監測頻率(lv)，并(bing)做出(chu)(chu)(chu)(chu)了(le)明確規定。而(er)(er)對(dui)(dui)于(yu)無(wu)菌(jun)檢(jian)(jian)(jian)査(cha)OOS結(jie)果(guo)(guo)(guo)(guo)(guo)的(de)(de)(de)(de)(de)調(diao)(diao)査(cha)，需(xu)核實的(de)(de)(de)(de)(de)相關記錄和(he)(he)(he)影響(xiang)因(yin)素更為繁雜(za)。基于(yu)它的(de)(de)(de)(de)(de)復(fu)雜(za)性(xing)(xing)，OOS結(jie)果(guo)(guo)(guo)(guo)(guo)的(de)(de)(de)(de)(de)調(diao)(diao)查(cha)須追溯到實驗(yan)(yan)(yan)(yan)過(guo)程的(de)(de)(de)(de)(de)每一個(ge)環節，而(er)(er)對(dui)(dui)于(yu)它的(de)(de)(de)(de)(de)變異性(xing)(xing)，調(diao)(diao)查(cha)過(guo)程又需(xu)針對(dui)(dui)不(bu)同的(de)(de)(de)(de)(de)OOS結(jie)果(guo)(guo)(guo)(guo)(guo)著(zhu)重分析(xi)調(diao)(diao)查(cha)相應的(de)(de)(de)(de)(de)不(bu)同環節。
對(dui)(dui)(dui)于(yu)微生(sheng)物實(shi)(shi)(shi)驗室(shi)OOS的(de)(de)調(diao)(diao)(diao)查(cha)，局(ju)限(xian)于(yu)每(mei)個檢驗單(dan)位的(de)(de)技術水平(ping)和資源，同樣限(xian)于(yu)人類對(dui)(dui)(dui)微生(sheng)物掌握的(de)(de)局(ju)限(xian)，不是每(mei)次的(de)(de)OOS調(diao)(diao)(diao)査都可(ke)(ke)以發現其(qi)根本原(yuan)因，但通過(guo)此調(diao)(diao)(diao)査過(guo)程仍能夠幫(bang)助調(diao)(diao)(diao)查(cha)者(zhe)找出(chu)超標(biao)結果發生(sheng)的(de)(de)可(ke)(ke)能原(yuan)因并進(jin)(jin)而采取糾正預防措施(shi)，基于(yu)風(feng)險分析，對(dui)(dui)(dui)相關批(pi)次產品做出(chu)最后處理決定'從而降低(di)藥品質量風(feng)險，既是保(bao)證藥品質量的(de)(de)重要工作，又是質量體(ti)系持續(xu)改(gai)進(jin)(jin)的(de)(de)原(yuan)動力。本文通過(guo)對(dui)(dui)(dui)4批(pi)無菌(jun)產品的(de)(de)無菌(jun)檢査實(shi)(shi)(shi)驗全過(guo)程的(de)(de)回顧性分析和調(diao)(diao)(diao)查(cha)，探(tan)索導致無菌(jun)實(shi)(shi)(shi)驗OOS結果的(de)(de)明確原(yuan)因，以期建(jian)立微生(sheng)物實(shi)(shi)(shi)驗室(shi)完(wan)善的(de)(de)OOS調(diao)(diao)(diao)査方案。
1、材料、儀(yi)器與試劑
全自動智能(neng)無(wu)菌集菌儀(上(shang)海(hai)秉越zw-2008)一(yi)次性(xing)使用全封閉(bi)集菌培養器(qi)顯(xian)微鏡(jing)AxioScopeA
全(quan)自(zi)動微生(sheng)物(wu)鑒定(ding)儀
酵母菌鑒定卡(ka)
無菌檢查樣品為4個批號的注射用頭孢噻膀鈉。
2、方法(fa)與(yu)結果(guo)
2.1實驗方(fang)法
 
2.1.1藥品的無(wu)菌(jun)檢查(cha)
依照《中(zhong)國(guo)藥典》2010年版_檢驗注射用頭孢噻肟(wo)鈉的(de)無菌檢查(cha)項目。
2.1.2鏡檢及鑒定
取陽(yang)性樣本，劃線TSA平板培養(yang)24~48h，按(an)照儀(yi)器及試劑的使用(yong)說明，對(dui)經(jing)過純(chun)化的微生物進(jin)行(xing)革蘭氏(shi)染色，確定微生物形(xing)態，然后根據形(xing)態選擇鑒(jian)定卡，使用(yong)全自動微生物鑒(jian)定儀(yi)Vitek2Compact進(jin)行(xing)鑒(jian)定。
 
2.2結果
 
4個批號的(de)(de)注射用頭孢噻(sai)肟鈉的(de)(de)無菌(jun)檢查檢驗結果如表1所示(shi)：2號和4號樣品改良(liang)馬丁(ding)(ding)培(pei)(pei)(pei)養基均(jun)在第3天變渾濁(zhuo)。取改良(liang)馬丁(ding)(ding)培(pei)(pei)(pei)養液(ye)劃(hua)線TSA平(ping)板(ban)，30~35℃培(pei)(pei)(pei)養48h，平(ping)板(ban)上呈現(xian)白色、光(guang)滑(hua)、邊緣整齊、形態單一的(de)(de)菌(jun)落。
革(ge)蘭氏染色鏡檢結果為酵(jiao)母菌。經全(quan)自動微生物鑒定儀Vitek2Compact鑒定，均(jun)為季也(ye)蒙假絲酵(jiao)母。
 
3、OOS結(jie)果(guo)的調查和分析
依據新版GMP對OOS調查(cha)的要(yao)求，回顧性(xing)分析調查(cha)注射用頭孢噻肟鈉無(wu)菌(jun)檢查(cha)OOS結(jie)果產生的原因。
 
①日(ri)常監控和驗收記錄(lu)：
培養基的驗(yan)收記錄(lu)、培養基的制備和(he)(he)滅菌(jun)(jun)記錄(lu)、檢驗(yan)器具準備和(he)(he)滅菌(jun)(jun)記錄(lu)、消毒液配置和(he)(he)無菌(jun)(jun)過濾記錄(lu)、潔(jie)凈室清(qing)潔(jie)消毒記錄(lu)、檢驗(yan)員使用潔(jie)凈服的滅菌(jun)(jun)記錄(lu)和(he)(he)使用記錄(lu)、無菌(jun)(jun)檢驗(yan)操(cao)作記錄(lu)以及環境監控(kong)記錄(lu)等均未發(fa)現異常(chang)。
②人員(yuan)：
甲和乙(yi)實驗人員均能熟練掌握(wo)無菌檢(jian)驗的(de)流程、監(jian)控要點和無菌操(cao)作(zuo)規范。
③樣品：
確(que)認樣(yang)品的(de)編(bian)號和批號無誤，無菌檢査(cha)取樣(yang)前，樣(yang)品西林(lin)瓶外(wai)觀(guan)正常，西林(lin)瓶蓋并未(wei)發現松動(dong)的(de)跡象。
④實驗器具：
實驗(yan)中(zhong)使用(yong)的py330集(ji)菌(jun)器、一次件使用(yong)無菌(jun)注射器以及一次性使用(yong)無菌(jun)手套的無菌(jun)驗(yan)收(shou)均(jun)符合規定，且用(yong)于當(dang)天(tian)其他檢品的檢驗(yan)，并(bing)未發現(xian)污染情況。
⑤培養基及沖洗液和稀釋液：
無菌檢(jian)查(cha)(cha)用(yong)培養基的(de)陰(yin)性對照(zhao)均(jun)符合規定，且(qie)同批制備(bei)和滅菌的(de)培養基用(yong)于同日檢(jian)查(cha)(cha)的(de)其他(ta)檢(jian)品，并未(wei)發現(xian)污染(ran)情況。
⑥檢驗環(huan)境：
現場環境(jing)監控的3皿沉降菌(jun)監測(ce)的TSA平(ping)皿均未有菌(jun)落生(sheng)長(chang)，并未出現污染情況。定期(qi)環境(jing)檢測(ce)表(biao)面菌(jun)符合規定，樣品無菌(jun)檢查(cha)當日潔凈空(kong)調系統均運行(xing)正常。
⑦不同檢驗體系對結果判(pan)定造成(cheng)的影響(xiang)：
由于(yu)現行《中(zhong)國(guo)藥(yao)典》無菌(jun)檢(jian)查使(shi)用的(de)改良馬丁(ding)培(pei)養基不同于(yu)國(guo)際標準使(shi)用的(de)TSB,將改良馬丁(ding)培(pei)養物劃線TSA平(ping)板上長出(chu)的(de)菌(jun)落接(jie)種(zhong)至TSB培(pei)養液中(zhong)in),24h后培(pei)養液即出(chu)現混濁現象(xiang)。因(yin)此(ci)可以排除因(yin)檢(jian)驗(yan)(yan)體系不同造成的(de)實(shi)驗(yan)(yan)結果偏差。
⑧菌株：
樣品檢(jian)出菌經鑒(jian)定為季也蒙假絲酵(jiao)母菌，比(bi)對曰常潔凈室監(jian)控收集的菌株建立(li)的菌庫，潔凈室中從未(wei)監(jian)測到此種菌株。
⑨附加實驗(yan)的結果(guo)與分析(xi)：
通過(guo)以(yi)上(shang)分析，初步認定無(wu)菌(jun)不合格為實驗有(you)效結(jie)果。但鑒于此次無(wu)菌(jun)檢(jian)(jian)驗過(guo)程并未嚴(yan)格按照(zhao)新版GMP和(he)《中國藥典》2015年版規(gui)定的(de)對檢(jian)(jian)驗環(huan)境(jing)和(he)人員的(de)全面(mian)監(jian)控，環(huan)境(jing)和(he)人員帶來的(de)污染仍有(you)造成OOS結(jie)果的(de)可能性，附加實驗就(jiu)是對檢(jian)(jian)驗環(huan)境(jing)進行全面(mian)監(jian)測。
現場環(huan)境監(jian)(jian)控按照新版GMP的要求實(shi)施，并增加對(dui)潔(jie)凈室(shi)回風(feng)口浮游菌(jun)(jun)(jun)的監(jian)(jian)測(ce)，監(jian)(jian)測(ce)結(jie)果(guo)均符(fu)合(he)規定。微(wei)生物(wu)監(jian)(jian)測(ce)方面，除(chu)實(shi)驗人員(yuan)無菌(jun)(jun)(jun)服胸口處采(cai)集到一個菌(jun)(jun)(jun)落，其他均未有菌(jun)(jun)(jun)落生長(chang)。實(shi)驗人員(yuan)無菌(jun)(jun)(jun)服采(cai)集到的菌(jun)(jun)(jun)落為革蘭氏陽性球菌(jun)(jun)(jun)，經(jing)鑒(jian)定為Kocuriakristinae(克氏庫克菌(jun)(jun)(jun)），此(ci)菌(jun)(jun)(jun)種曾在日常(chang)潔(jie)凈室(shi)監(jian)(jian)控中(zhong)不(bu)止一次檢出(chu)過，并未對(dui)樣(yang)品產生過污染。
4、結(jie)論與討論
OOS結果表明，并(bing)未在實驗室發現(xian)導(dao)致(zhi)OOS結果的明確原因，檢出菌也并(bing)非由于實驗室檢驗過程帶來的污染，懷(huai)疑樣品本身被(bei)季(ji)也蒙(meng)假絲(si)酵母菌所污染，從而(er)導(dao)致(zhi)無菌檢查的陽(yang)性結果。
通過對上述OOS的(de)調查和分(fen)析，初步建立了微(wei)生物實驗(yan)室OOS結果調查的(de)分(fen)析方(fang)案(an)，分(fen)別從人、機、料、法、環(huan)5個方(fang)面進(jin)行闡述：
人(ren)——實驗(yan)人(ren)員(yuan)。考(kao)察(cha)人(ren)員(yuan)是否經過(guo)相關檢驗(yan)的培(pei)訓和(he)(he)考(kao)核(he)，是否了解該(gai)項(xiang)檢驗(yan)的流程和(he)(he)監控要(yao)點。無菌區(qu)全體人(ren)員(yuan)每年應進行(xing)一(yi)次(ci)再培(pei)訓和(he)(he)資格(ge)的再確認(ren)，對無菌區(qu)人(ren)員(yuan)操作(zuo)服和(he)(he)手套表面的微生物(wu)監測(ce)嚴格(ge)按新版GMP執行(xing)；
機——實驗(yan)中使(shi)用(yong)(yong)的(de)儀(yi)器(qi)(qi)設(she)備。檢查(cha)集菌(jun)儀(yi)等儀(yi)器(qi)(qi)近期使(shi)用(yong)(yong)記錄(lu)是否發(fa)現異常，參數設(she)置是否正確(que)。儀(yi)器(qi)(qi)的(de)計量(liang)和校準均需在有效期內(nei)，無(wu)菌(jun)區內(nei)使(shi)用(yong)(yong)的(de)儀(yi)器(qi)(qi)需定(ding)期消(xiao)毒(du)并定(ding)期進行微生(sheng)物的(de)表(biao)面(mian)監測(ce)，使(shi)用(yong)(yong)的(de)器(qi)(qi)具需經滅菌(jun)消(xiao)毒(du)，一(yi)次性使(shi)用(yong)(yong)器(qi)(qi)具需經質(zhi)量(liang)驗(yan)收；
料——樣(yang)(yang)品(pin)(pin)、培(pei)養基、稀釋液和沖洗液。檢查剩余樣(yang)(yang)品(pin)(pin)的(de)編(bian)號(hao)和批號(hao)是(shi)否準確，樣(yang)(yang)品(pin)(pin)的(de)外觀是(shi)否異常，瓶(ping)蓋是(shi)否有松脫現(xian)象以(yi)及樣(yang)(yang)品(pin)(pin)的(de)前期存(cun)放(fang)條件和取樣(yang)(yang)方式(shi)是(shi)否合理。必要時(shi)，對(dui)樣(yang)(yang)品(pin)(pin)的(de)瓶(ping)蓋和瓶(ping)口等關(guan)鍵部位擦抹取樣(yang)(yang)，培(pei)養觀察；
檢(jian)查培養基質(zhi)量驗(yan)收記(ji)錄(lu)和配(pei)制記(ji)錄(lu)，確認配(pei)制和滅菌(jun)是否合(he)理有效，是否用于其他樣品的(de)檢(jian)驗(yan)，培養基、稀釋液和沖洗液的(de)陰(yin)性(xing)對照應(ying)符合(he)規定；
法——檢驗(yan)(yan)(yan)方法和依(yi)據。實驗(yan)(yan)(yan)所用標準應符合設定實驗(yan)(yan)(yan)和檢驗(yan)(yan)(yan)依(yi)據的要求；
環——實驗環境。檢(jian)查(cha)潔(jie)(jie)(jie)凈(jing)空(kong)調系統是否(fou)運行正(zheng)常(chang)，監測記(ji)錄包括(kuo)定期監控記(ji)錄和實驗現場環境監控記(ji)錄，是否(fou)符(fu)合潔(jie)(jie)(jie)凈(jing)度(du)要求，清潔(jie)(jie)(jie)記(ji)錄顯示是否(fou)按時清潔(jie)(jie)(jie)，消(xiao)毒(du)液(ye)是否(fou)使用(yong)合理(li)。另外，未確定OOS結(jie)果產生的明(ming)確原因時，不能急于對(dui)環境進(jin)行消(xiao)毒(du)處理(li)，以免忽略了可(ke)能的環境污染因素。
 
微(wei)生(sheng)物負荷和實驗(yan)檢出(chu)菌(jun)的(de)比對(dui)分析。實驗(yan)室的(de)微(wei)生(sheng)物負荷，包括(kuo)潔(jie)凈(jing)室的(de)空氣微(wei)生(sheng)物、表面微(wei)生(sheng)物和人員操作服(fu)及手套的(de)表面微(wei)生(sheng)物。對(dui)日常環境監控收(shou)集的(de)菌(jun)株進行(xing)有(you)效(xiao)鑒別和分析，建立(li)潔(jie)凈(jing)室生(sheng)物負載數(shu)據(ju)庫，可為微(wei)生(sheng)物OOS調査提供數(shu)據(ju)基礎。
 
對檢(jian)出菌(jun)進行(xing)鑒(jian)定(ding)，分(fen)(fen)析監控收集的(de)微(wei)生(sheng)物分(fen)(fen)布和鑒(jian)定(ding)與陽(yang)性結果(guo)的(de)相關性，當(dang)發現與陽(yang)性菌(jun)株相近的(de)菌(jun)株時，可利(li)用分(fen)(fen)子(zi)生(sheng)物學方法比對陽(yang)性菌(jun)株與微(wei)生(sheng)物負荷的(de)同源性，為陽(yang)性菌(jun)的(de)污染(ran)溯源提供(gong)依據。
此外，對(dui)不(bu)同(tong)(tong)實驗會產生不(bu)同(tong)(tong)的(de)OOS結果，可針對(dui)某些相關環節靈(ling)活考察。例如，針對(dui)不(bu)同(tong)(tong)的(de)微(wei)生物，采用不(bu)同(tong)(tong)的(de)監(jian)測手段(duan)，陽性檢出菌(jun)為酵母(mu)菌(jun)時，增加沙氏葡(pu)萄糖瓊脂用于環境監(jian)控(kong)的(de)附加實驗，則能夠更好地確認環境中的(de)該類微(wei)生物。
需要著重(zhong)強調(diao)的(de)(de)是，檢出菌的(de)(de)鑒別(bie)對于OOS結果(guo)的(de)(de)調(diao)查非(fei)常關鍵，決(jue)定最后(hou)是否可以發現(xian)根本(ben)原因，應該給(gei)予足夠(gou)重(zhong)視(shi)。
綜上(shang)所述，微生(sheng)物相關檢(jian)驗(yan)項目OOS結果的調查工作(zuo)(zuo)量很(hen)大，且專業性(xing)強(qiang)，實驗(yan)室不僅需要具備受過良(liang)好培訓(xun)和具有豐富檢(jian)驗(yan)經驗(yan)的工作(zuo)(zuo)人(ren)員，還需建(jian)立完善的OOS調查方(fang)案來規范調查操作(zuo)(zuo)。